按照细胞冻存的步骤来看，细胞在4度的温度下只能放置10分钟，如果超过10分钟，会造成细胞污染等不利情况。当然，细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术，添加冷冻保护剂可以很好的改善细胞的破坏与死亡情况。

　　试管冷冻细胞的方法

　　一般来说，细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。既可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，又起到了细胞保种的作用。而冷冻细胞有以下两种方法：

　　1、传统方法：

　　放好胚胎的冷存管置于4℃10分钟、-20℃30分钟、-80℃16～18小时(或隔夜)、液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

　　2、程序降温：

　　利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至(-80℃以下)-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。

　　细胞冻存添加保护剂

　　细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术，添加冷冻保护剂可以很好的改善细胞的破坏与死亡情况。细胞在不加任何保护剂的情况下冷冻，细胞内外的水分会很快形成水晶从而引发一系列的不良反应：首先，部分蛋白质因局部电解质浓度增高和pH值改变而变性，导致细胞内部空间结构发生改变。其次，细胞内冰晶的形成和细胞膜系统上蛋白质，酶的变性等会限碍细胞的能量代谢。再次，胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易发生破坏引起胞膜通透性的改变，使细胞内容物丧失。最后，随着冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成DNA的空间结构发生损伤从而引起细胞死亡。

　　细胞冷冻的注意事项

　　1、缓慢冷冻：慢冻可使细胞逐步脱水，细胞不会因产生大的冰晶而受到损害。相反，细胞内若出现大结晶会引起细胞膜、细胞器的损伤和破裂。

　　2、细胞活力及浓度：细胞应在生长良好、培养瓶致密度约为80-90%、活力达90%以上的状态下冻存。细胞活力差的细胞在冻存后的成活率很小，因此，一定要在细胞旺盛分裂时期冻存。

　　3、冻存密度：冻存时细胞密度少于5x105个活细胞/mL时，很难成功复苏。

　　4、冻存管盖子：冻存管的盖子一定要拧紧，否则水浴复苏时水会渗入造成污染。

　　5、冻存时间：细胞不可长期保存在-80℃冰箱中。建议在-80℃冰箱中的保存时间不要超过48h(一般只需要12小时过夜即可)。

　　总之，按照细胞冻存的步骤来看，细胞在4度的温度下只能放置10分钟，如果超过10分钟，会造成细胞污染等不利情况。